Любовь Ивановна Станкевич, кандидат медицинских наук, заведующая отделением лабораторной диагностики Hadassah Medical Moscow, рассказала о видах тестов на COVID-19, их различиях и особенностях.
Для чего необходима лабораторная диагностика вируса SARS-Cov-2:
МЕТОДЫ:
Каждый из подходов имеет свои плюсы и минусы, ограничения, особенности интерпретации и использования в зависимости от стадии заболевания. Универсального подхода не существует.
Прямые методы детекции вируса по фрагментам генома молекулярно-генетическими методами.
Китайские исследователи первыми изучили структуру генома вируса SARS-Cov-2 (штамм коронавируса 2019 года) ввиду начала эпидемии именно в этой стране. По их данным, геномная последовательность нового SARS-Cov2 вируса на 70% идентична геному предыдущего штамма вирусу SARS-Cov. В качестве мишени детекции, например, у азиатских производителей, выбран ген нуклеокапсида (N1), специфичный для нового штамма вируса SARS-Cov2.
Подавляющее большинство молекулярно-генетических методов – это метод Real-Time ПЦР с обратной транскрипцией для выявления РНК вируса. Для такого тестирования может использоваться материал верхних и нижних дыхательных путеи (соскоб эпителия со слизистой ротоглотки, носоглотки, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж).
Неоспоримое преимущество метода ПЦР – это прямое суждение о факте инфицирования в случае получения положительного результата.
Неверная интерпретация отрицательных результатов, полученных методом ПЦР может приводить к неверным клиническим выводам, неправильной эпидемиологической оценке ситуации и карантинным мерам.
Необходимо принимать во внимание правила интерпретации результатов молекулярно-генетических методов на вирус SARS-Cov2, которые выглядят следующим образом:
Отрицательный результат не может исключить возможность наличия COVID-19.
Следует проводить повторное исследование, причем в соответствии с международными рекомендациями, из другого, повторно взятого образца материала, чего на практике практически никто не делает. Существующий, например, в РФ протокол подтверждения – это повторное тестирование в экспертной лаборатории того же самого образца, что означает защиту от ложноположительного результата, но не от ложноотрицательного.
Клиническая и эпидемиологическая проблема — ложноотрицательные результаты.
Причина такого положения дел кроется в характере поведения вируса SARS-Cov2 и развития COVID-19. Вирус использует слизистую носа и носоглотки в качестве входных ворот, а слизистую нижних дыхательных путей в качестве мишени инфицирования. То есть в материале верхних дыхательных путей вирус можно обнаружить только в период «транзиторного окна», довольно непродолжительное время.
Показано, что тестирование методом ПЦР на SARS-Cov-2 мазка из носоглотки и мокроты более эффективно, чем тестирование мазков из горла. По последним данным, мазки из горла НЕ рекомендуются для тестирования на вирус SARS-Cov-2, особенно при взятии материала в период с 8-го по 14-ыи день и более 15 дней после начала болезни, особенно у пациентов со стертой симптоматикой. Наиболее достоверным биоматериалом для исследования методом ПЦР является мокрота (Yang et al, 2020).
Характер получения биоматериала для анализа методом ПЦР может иметь следующие недостатки:
Ни в коем случае нельзя допускать процедуры самостоятельного взятия мазков, пациент не может самостоятельно сделать качественный соскоб с ротоглотки и носоглотки, безопасность процедуры также не может быть обеспечена без визуального контроля.
Другими лимитирующими факторами использования молекулярно-генетических методов является длительность протоколов метода ПЦР и аналогов (часы) и ограниченная их доступность. Это приводит к тому, что результатов исследования приходится ожидать несколько суток, что совершенно недопустимо для эффективного выбора тактики терапии в случае стремительно развивающейся симптоматики.
В настоящее время делаются попытки обойти временной фактор. Для этого множество предприятии и в России, и за рубежом ведут разработки по оптимизации и миниатюризации технологии ПЦР анализа. Уже есть данные о сокращении метода ПЦР до 1 часа или даже менее того, выпуске компактных вариантов оборудования, что называется «на одном столе». Однако в подавляющем большинстве эти заявления касаются протокола проведения самой ПЦР-реакции уже после выделения нуклеиновых кислот. Этап выделения как самостоятельную технологию с дополнительными манипуляциями и временными затратами тоже нужно учитывать в общем времени на анализ.
Справедливости ради стоит заметить, что разработка экспресс-методов экстракции нуклеиновых кислот также ведутся и тоже могут быть сведены к одному этапу и затратам времени менее часа. В любом случае, метод амплификации нуклеиновых кислот и его аналоги до сих пор остаются многоэтапным и требуют специально организованных помещении, персонала, специальных разрешении и лицензии для работы с ПБА III-IV групп патогенности (вирус SARS-Cov2 отнесен ко II группе патогенности по россии скои классификации). Мощности таких лаборатории недостаточны для массового охвата населения и только ограниченное количество лаборатории может развернуть у себя тестирование на вирус SARS-Cov2 в условиях, когда стоит острая необходимость массового тестирования многомиллионного населения страны. Остро необходима мобилизация лабораторного тестирования для клинических целеи для пациентов, поступающих в стационары с симптомами и ожидающих подтверждающего ответа для начала специфической терапии. В настоящий момент данное окно ожидания составляет минимум 48-72 часа.
Решением последних двух проблем может стать настоящий экспресс-метод ПЦР анализа. Возможность такого анализа (20 минут от взятия мазка до результата, в формате POCT (point-of-care) миниатюрного прибора, который может быть установлен в кабинете врача и использован во время врачебного приема или в условиях приемного отделения) теоретически существует, но, к сожалению, до сих пор такое решение не доступно для массового использования.
Обоснованием такого тестирования является тот факт, что инфицирование вирусом SARS-Cov-2 стимулирует выработку иммунного ответа у пациента – появление специфических антител анти-SARS-Cov-2. Иммунный ответ в случае COVID-19 развивается по классическим механизмам, в крови можно обнаруживать антитела:
Данные антител имеют защитное значение для индивидуума и могут использоваться в терапевтических целях для тяжелых пациентов (идет накопление данных об использовании плазмы от переболевших для терапии пациентов с тяжелыми формами COVID-19). Факт наличия/отсутствия таких антител может быть использован для лабораторного тестирования в диагностических целях.
Основное преимущество иммунологического тестирования на антитела к SARS-Cov2 – это выявление бессимптомных носителей, которые могут составлять значительную часть населения.
Чтобы иметь представление о том, насколько принимаемые меры по социальному дистанцированию эффективны, а также иметь возможность прогнозировать длительность карантинных мероприятий, необходимо знать, какой процент населения имеет легкие/бессимптомные случаи COVID-19.
Появляется все больше данных о том, что термометрия не является 100% эффективным методом выявить и изолировать заболевших и что в распространении эпидемии участвует значительное количество бессимптомных/малосимптомных пациентов. В Китае порядка 86% случаев передачи инфекции в начале эпидемии имело место через людей с нормальной температурой тела и не обращавшихся к врачу (профессор Джефри Шаман, Колумбийский Университет, статья в журнале Science).
Опыт массового тестирования в Исландии показал, что около половины тех, у кого был выявлен положительныи результат на вирус SARS-Cov-2, не имели клинических симптомов (профессор Торольфур Гуднасон, BuzzFeed News).
Тестирование на антитела к вирусу SARS-Cov-2 может быть использовано:
Технологические особенности иммунологического тестирования на антитела таковы, что оно может быть выполнено как в формате классического иммунно-фермантного анализа (ИФА), так и в формате бесприборного иммунохроматографического экспресс-теста.
В основе иммунных реакций, например, у европейских производителей, используется рекомбинантный структурный белок (S1 домен) вируса SARS-Cov2. Оба варианта позволяют выявлять in vitro специфические антитела к вирусу SARS-Cov-2 и раздельно дифференцировать класс антител (IgG, IgM или IgA). В формате ИФА результат может быть качественным или полуколичественным (относительное представление о коэффициенте позитивности (количественныи стандарт пока еще в мире не разработан). В экспресс-формате результат получают качественный – обнаружены или не обнаружены специфические антитела определенного класса.
Биоматериалом для исследования является кровь (в зависимости от типа тестирования могут быть использованы капиллярная кровь, сыворотка, плазма, цельная венозная кровь), что значительно стандартизирует биоматериал и сводит преаналитические риски практически к нулю.
Минимальное время до получения результата 10-15 минут в формате экспресс-тестирования, 2 часа в формате ИФА анализа.
Исследование на антитела не требует специальных условий, разрешений и особого лицензирования, специально обученного персонала, это значительно дешевле и быстрее ПЦР-исследовании, что может сделать его действительно массовым и доступным.
Большинство лабораторий имеют возможность проводить исследования в формате ИФА в полуавтоматическом или автоматическом режиме без каких-либо ограничений. Бесприборный экспресс-тест на антитела, как показывает практика азиатских стран (например, Южная Корея), где с эпидемией удалось справиться ранее, может иметь ключевую роль в доступности массового тестирования для выявления бессимптомных носителей.
Правила интерпретации иммунологического исследования на антитела независимо от метода (экспресс-тест или ИФА):
Ограничения при интерпретации иммунологического тестирования на антитела к вирусу SARS-Cov2 следующие:
Таким образом, оптимальным решением для клинических задач (подтверждение диагноза COVID, определение тактики ведения пациента (изоляция, госпитализация), быстрого мотивированного выбора правильной терапии) может быть комбинация лабораторных и инструментальных методов диагностики COVID-19 по следующему алгоритму:
Для эпидемиологических целей (массовое тестирование населения, выявление скрытых носителей, выявление лиц, перенесших заболевание) наиболее эффективным и достаточным представляется тестирование на антитела к вирусу SARS-Cov2.