Лабораторная диагностика вируса SARS-Cov-2

Любовь Ивановна Станкевич, кандидат медицинских наук, заведующая отделением лабораторной диагностики Hadassah Medical Moscow, рассказала о видах тестов на COVID-19, их различиях и особенностях.
Лабораторная диагностика вируса SARS-Cov-2

Любовь Ивановна Станкевич, кандидат медицинских наук, заведующая отделением лабораторной диагностики Hadassah Medical Moscow, рассказала о видах тестов на COVID-19, их различиях и особенностях.

Для чего необходима лабораторная диагностика вируса SARS-Cov-2:

  • Установление факта инфицирования вирусом SARS-Cov-2
  • Мониторинг течения заболевания COVID
  • Контроль излеченности
  • Эпидемиологический мониторинг ситуации — планирование карантинных мероприятий

МЕТОДЫ:

  • Прямые методы детекции вируса по фрагментам генома молекулярно-генетическими методами (различные модификации метода ПЦР, гибридизация в комбинации с мультиплексными технологиями и другие)
  • Косвенные методы выявления различных классов антител, основанных на формировании иммунного ответа на SARS-Cov-2 (детекции специфических антител IgG, IgM, IgA методами иммуно-ферментного анализа, иммунохроматографическими методами и их аналогами)

Каждый из подходов имеет свои плюсы и минусы, ограничения, особенности интерпретации и использования в зависимости от стадии заболевания. Универсального подхода не существует.

Прямые методы детекции вируса по фрагментам генома молекулярно-генетическими методами.

Китайские исследователи первыми изучили структуру генома вируса SARS-Cov-2 (штамм коронавируса 2019 года) ввиду начала эпидемии именно в этой стране. По их данным, геномная последовательность нового SARS-Cov2 вируса на 70% идентична геному предыдущего штамма вирусу SARS-Cov. В качестве мишени детекции, например, у азиатских производителей, выбран ген нуклеокапсида (N1), специфичный для нового штамма вируса SARS-Cov2.

Подавляющее большинство молекулярно-генетических методов – это метод Real-Time ПЦР с обратной транскрипцией для выявления РНК вируса. Для такого тестирования может использоваться материал верхних и нижних дыхательных путеи (соскоб эпителия со слизистой ротоглотки, носоглотки, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж).

Неоспоримое преимущество метода ПЦР – это прямое суждение о факте инфицирования в случае получения положительного результата.

Неверная интерпретация отрицательных результатов, полученных методом ПЦР может приводить к неверным клиническим выводам, неправильной эпидемиологической оценке ситуации и карантинным мерам.

Необходимо принимать во внимание правила интерпретации результатов молекулярно-генетических методов на вирус SARS-Cov2, которые выглядят следующим образом:

  • Положительныи результат означает инфекцию, COVID-19
  • Отрицательный результат может означать в равной степени:
    • отсутствие инфекции
    • раннюю стадию инфицирования
    • стадию выздоровления

Отрицательный результат не может исключить возможность наличия COVID-19.

Следует проводить повторное исследование, причем в соответствии с международными рекомендациями, из другого, повторно взятого образца материала, чего на практике практически никто не делает. Существующий, например, в РФ протокол подтверждения – это повторное тестирование в экспертной лаборатории того же самого образца, что означает защиту от ложноположительного результата, но не от ложноотрицательного.

Клиническая и эпидемиологическая проблема — ложноотрицательные результаты.

Причина такого положения дел кроется в характере поведения вируса SARS-Cov2 и развития COVID-19. Вирус использует слизистую носа и носоглотки в качестве входных ворот, а слизистую нижних дыхательных путей в качестве мишени инфицирования. То есть в материале верхних дыхательных путей вирус можно обнаружить только в период «транзиторного окна», довольно непродолжительное время.

Показано, что тестирование методом ПЦР на SARS-Cov-2 мазка из носоглотки и мокроты более эффективно, чем тестирование мазков из горла. По последним данным, мазки из горла НЕ рекомендуются для тестирования на вирус SARS-Cov-2, особенно при взятии материала в период с 8-го по 14-ыи день и более 15 дней после начала болезни, особенно у пациентов со стертой симптоматикой. Наиболее достоверным биоматериалом для исследования методом ПЦР является мокрота (Yang et al, 2020).

Характер получения биоматериала для анализа методом ПЦР может иметь следующие недостатки:

  • в подавляющем большинстве случаев для тестирования берут материал верхних дыхательных путеи (миндалины, ротоглотка, носоглотка), тогда как рекомендованным материалом является материал нижних дыхательных путеи
  • качество биоматериала чувствительно к соблюдению строгих правил преаналитики (за 3-4 часа до исследования не пить, не употреблять пищу, не курить, не чистить зубы, не полоскать рот, не использовать жевательную резинку)
  • взятие биоматериала из ротоглотки и носоглотки представляет дискомфорт для пациента, может вызывать кровотечения
  • правильное взятие материала из правильного локуса требует обученного персонала и специальных условии .

Ни в коем случае нельзя допускать процедуры самостоятельного взятия мазков, пациент не может самостоятельно сделать качественный соскоб с ротоглотки и носоглотки, безопасность процедуры также не может быть обеспечена без визуального контроля.

  • высокий риск заражения медработников при взятии мазков
  • мазки и соскобы в любом случае не могут предоставить максимально адекватный материал для анализа из нижних отделов респираторного тракта

Другими лимитирующими факторами использования молекулярно-генетических методов является длительность протоколов метода ПЦР и аналогов (часы) и ограниченная их доступность. Это приводит к тому, что результатов исследования приходится ожидать несколько суток, что совершенно недопустимо для эффективного выбора тактики терапии в случае стремительно развивающейся симптоматики.

В настоящее время делаются попытки обойти временной фактор. Для этого множество предприятии и в России, и за рубежом ведут разработки по оптимизации и миниатюризации технологии ПЦР анализа. Уже есть данные о сокращении метода ПЦР до 1 часа или даже менее того, выпуске компактных вариантов оборудования, что называется «на одном столе». Однако в подавляющем большинстве эти заявления касаются протокола проведения самой ПЦР-реакции уже после выделения нуклеиновых кислот. Этап выделения как самостоятельную технологию с дополнительными манипуляциями и временными затратами тоже нужно учитывать в общем времени на анализ.

Справедливости ради стоит заметить, что разработка экспресс-методов экстракции нуклеиновых кислот также ведутся и тоже могут быть сведены к одному этапу и затратам времени менее часа. В любом случае, метод амплификации нуклеиновых кислот и его аналоги до сих пор остаются многоэтапным и требуют специально организованных помещении, персонала, специальных разрешении и лицензии для работы с ПБА III-IV групп патогенности (вирус SARS-Cov2 отнесен ко II группе патогенности по россии скои классификации). Мощности таких лаборатории недостаточны для массового охвата населения и только ограниченное количество лаборатории может развернуть у себя тестирование на вирус SARS-Cov2 в условиях, когда стоит острая необходимость массового тестирования многомиллионного населения страны. Остро необходима мобилизация лабораторного тестирования для клинических целеи для пациентов, поступающих в стационары с симптомами и ожидающих подтверждающего ответа для начала специфической терапии. В настоящий момент данное окно ожидания составляет минимум 48-72 часа.

Решением последних двух проблем может стать настоящий экспресс-метод ПЦР анализа. Возможность такого анализа (20 минут от взятия мазка до результата, в формате POCT (point-of-care) миниатюрного прибора, который может быть установлен в кабинете врача и использован во время врачебного приема или в условиях приемного отделения) теоретически существует, но, к сожалению, до сих пор такое решение не доступно для массового использования.

Иммунологические тесты на специфические антитела к вирусу SARS-Cov-2

Обоснованием такого тестирования является тот факт, что инфицирование вирусом SARS-Cov-2 стимулирует выработку иммунного ответа у пациента – появление специфических антител анти-SARS-Cov-2. Иммунный ответ в случае COVID-19 развивается по классическим механизмам, в крови можно обнаруживать антитела:

  • класса IgM (доклиническии, инкубационный период, появляются в среднем через 7 дней от момента инфицирования)
  • класса IgA так как входными воротами при инфицировании являются слизистые оболочки (IgA-антительныи ответ является быстрым и может быть обнаружен в короткие сроки до начала синтеза IgG антител).
  • класса IgG (появляются в среднем с 14-го дня от момента инфицирования независимо от факта развития заболевания.

Данные антител имеют защитное значение для индивидуума и могут использоваться в терапевтических целях для тяжелых пациентов (идет накопление данных об использовании плазмы от переболевших для терапии пациентов с тяжелыми формами COVID-19). Факт наличия/отсутствия таких антител может быть использован для лабораторного тестирования в диагностических целях.

Основное преимущество иммунологического тестирования на антитела к SARS-Cov2 – это выявление бессимптомных носителей, которые могут составлять значительную часть населения.

Чтобы иметь представление о том, насколько принимаемые меры по социальному дистанцированию эффективны, а также иметь возможность прогнозировать длительность карантинных мероприятий, необходимо знать, какой процент населения имеет легкие/бессимптомные случаи COVID-19.

Появляется все больше данных о том, что термометрия не является 100% эффективным методом выявить и изолировать заболевших и что в распространении эпидемии участвует значительное количество бессимптомных/малосимптомных пациентов. В Китае порядка 86% случаев передачи инфекции в начале эпидемии имело место через людей с нормальной температурой тела и не обращавшихся к врачу (профессор Джефри Шаман, Колумбийский Университет, статья в журнале Science).

Опыт массового тестирования в Исландии показал, что около половины тех, у кого был выявлен положительныи результат на вирус SARS-Cov-2, не имели клинических симптомов (профессор Торольфур Гуднасон, BuzzFeed News).

Тестирование на антитела к вирусу SARS-Cov-2 может быть использовано:

  1. Для диагностики острой инфекции (необходимо принимать во внимание наличие Lag-периода так как антительныи ответ формируется в среднем за 7-14 днеи после момента инфицирования). Рекомендуется раздельное тестирование на антитела класса IgM, IgA и IgG и мониторинг появления антител в динамике (детекция сероконверсии) — повторное тестирование в неясных случаях через 5-7 днеи.
  2. Разделение и сортировка пациентов на острые случаи и тех, кто перенес инфекцию.
  3. Экспресс-тестирование позволяет организовать эффективный point-of-care скрининг пациентов до получения результатов подтверждающего теста методом исключения пациентов, у которых могут быть подозрения на инфицирование SARS-Cov-2.
  4. Исключение пациентов, у которых могут быть подозрения на инфицирование SARS-Cov-2
  5. Выявление скрытых носителей для повышения эффективности карантинных мероприятий.
  6. Эпидемиологические расследования — выявление пациентов, перенесших заболевание в анамнезе.
  7. Выявление из числа переболевших потенциальных доноров плазмы с высоким содержанием антител анти-SARS-Cov2 для приготовления терапевтических препаратов.

Технологические особенности иммунологического тестирования на антитела

Технологические особенности иммунологического тестирования на антитела таковы, что оно может быть выполнено как в формате классического иммунно-фермантного анализа (ИФА), так и в формате бесприборного иммунохроматографического экспресс-теста.

В основе иммунных реакций, например, у европейских производителей, используется рекомбинантный структурный белок (S1 домен) вируса SARS-Cov2. Оба варианта позволяют выявлять in vitro специфические антитела к вирусу SARS-Cov-2 и раздельно дифференцировать класс антител (IgG, IgM или IgA). В формате ИФА результат может быть качественным или полуколичественным (относительное представление о коэффициенте позитивности (количественныи стандарт пока еще в мире не разработан). В экспресс-формате результат получают качественный – обнаружены или не обнаружены специфические антитела определенного класса.

Биоматериалом для исследования является кровь (в зависимости от типа тестирования могут быть использованы капиллярная кровь, сыворотка, плазма, цельная венозная кровь), что значительно стандартизирует биоматериал и сводит преаналитические риски практически к нулю.

Минимальное время до получения результата 10-15 минут в формате экспресс-тестирования, 2 часа в формате ИФА анализа.

Исследование на антитела не требует специальных условий, разрешений и особого лицензирования, специально обученного персонала, это значительно дешевле и быстрее ПЦР-исследовании, что может сделать его действительно массовым и доступным.

Большинство лабораторий имеют возможность проводить исследования в формате ИФА в полуавтоматическом или автоматическом режиме без каких-либо ограничений. Бесприборный экспресс-тест на антитела, как показывает практика азиатских стран (например, Южная Корея), где с эпидемией удалось справиться ранее, может иметь ключевую роль в доступности массового тестирования для выявления бессимптомных носителей.

Правила интерпретации иммунологического исследования на антитела независимо от метода (экспресс-тест или ИФА):

  1. Для понимания стадии заболевания всегда нужно исследовать пару антител разного класса: IgG и IgM, либо IgG и IgA.
  2. Интерпретировать результаты тестирования на антитела необходимо с учетом анамнеза и клинических данных, а также результатов других диагностических исследовании и процедур.
  3. Сравнение результатов тестирования в динамике добавляет клинической значимости иммунологическому исследованию.
  4. Интерпретировать нужно только парный результат одновременного тестирования различных классов антител по специальному алгоритму.

Ограничения при интерпретации иммунологического тестирования на антитела к вирусу SARS-Cov2 следующие:

  1. Существует серонегативное окно. От факта инфицирования до появления первых антител проходит в среднем 7 дней.
  2. Низкая гомология белка S1 SARS-Cov2 с аналогичным белком других представителей семейство коронавирусов сводит возможность перекрестных реакций к минимуму. Тем не менее, есть некая вероятность перекрестной положительной реакции с другими коронавирусами (зависит от качества тест-систем).
  3. Тесты на антитела класса IgM могут перекрестно реагировать с ревматоидным фактором – универсальный механизм перекрестных ложноположительных реакций на IgM антитела у ревматоидных больных.

Таким образом, оптимальным решением для клинических задач (подтверждение диагноза COVID, определение тактики ведения пациента (изоляция, госпитализация), быстрого мотивированного выбора правильной терапии) может быть комбинация лабораторных и инструментальных методов диагностики COVID-19 по следующему алгоритму:

  • Максимально быстрое тестирование (результат в день обращения) на наличие антител и сортировка пациентов в зависимости от анамнестических и эпидемиологических данных: кому необходимо подтверждающее исследование методом ПЦР, кому необходимо повторное исследование на антитела.
  • Термометрия и оксиметрия.
  • КТ легких.
  • Исследование методом ПЦР для пациентов с симптомами, с показаниями на госпитализацию.

Для эпидемиологических целей (массовое тестирование населения, выявление скрытых носителей, выявление лиц, перенесших заболевание) наиболее эффективным и достаточным представляется тестирование на антитела к вирусу SARS-Cov2.

Подробнее:
ТЕСТ НА КОРОНАВИРУС (COVID-19) В МОБИЛЬНОМ ПУНКТЕ ХАДАССА ДРАЙВ
ТЕСТИРОВАНИЕ НА АНТИТЕЛА К COVID-19 В HADASSAH MEDICAL MOSCOW

Для записи на тестирования:
8 (499) 588 86 71
covid@skolkovomed.com

Автор:
02.12.2020

На данной странице собраны все научные и просветительские мероприятия ГК "Медскан"

26.11.2020

прорыв в лечении метастатической увеальной меланомы

24.11.2020

Видеообращение и интервью Джули Флешман, президента международной организации по борьбе с раком поджелудочной железы PanCAN

Добро пожаловать на официальный сайт Hadassah Medical Skolkovo — филиала израильской больницы «Хадасса». Наша клиника открылась в Сколково (Международный медицинский кластер) 5 сентября 2018 года. Информация о ценах и специальных предложениях уже на сайте, ждём вас!
+7 (499) 588-86-19 Медицинский центр Hadassah Medical Skolkovo
121205 Россия Инновационный центр Сколково Москва Большой бульвар, 46с1